侵袭性真菌感染的抗原检测技术及临床意义
侵袭性真菌感染（invasive fungual infection，IFI）的发病率呈逐年上升趋势。尸检研究发现，75%的IFI病例在生前漏诊，而漏诊率高的主要原因是诊断困难，IFI的临床表现不典型易被基础疾病所掩盖，确诊通常需要侵入性的组织标本，而侵入性的操作过程常因患者的病情所限难以实施。为了提高IFI治疗的成功率、降低病死率，目前国内外都制定了相应的关于IFI的诊治指南，将IFI诊断分为确诊、临床诊断和拟诊三个级别。但确诊依据只有两条：组织病理学证据和活组织标本或正常情况下无菌腔液标本培养阳性，这给临床实践带来很大困难。为了提高诊断的阳性率，近年来几种非侵袭性实验室技术尤其是真菌抗原检测受到极大的关注，主要是β-D-葡聚糖和曲霉半乳甘露聚糖抗原检测的应用，并已成为真菌感染的诊断标准之一。
一、抗原检测在临床诊断中的应用
在我国近期制定的真菌感染诊断标准与治疗原则中，均将血液标本中真菌细胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖抗原（G试验）和曲霉半乳甘露聚糖抗原（GM）的检测作为临床诊断（疑诊）的微生物学检查依据之一，其敏感性和特异性均达到80%以上。这2项检测已被美国和欧洲许多国家批准用于血液、肿瘤等免疫受损者中侵袭性真菌感染的诊断。
1. 1,3-β-D-葡聚糖（1,3-beta-d-glucan，BG）：BG广泛存在于除接合菌、隐球菌之外的真菌细胞壁中，占真菌细胞壁成分的50%以上，在酵母菌中含量最高，其他微生物如细菌、病毒，以及动物、人体细胞均无此成分。BG由D-葡萄糖聚合而成，以β（1→3）糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分枝状β（1→6）糖苷键连接的葡萄糖残基作为侧链。BG能特异性激活自鲎变形细胞溶解产物中的凝血因子——G因子，此过程也称为G试验。目前市场上常用的G试验试剂盒有Fungitec-G（Seikagaku）和Glucatell（Associates of Cape Cod）两种，其不同点在于主要试剂G因子来自于不同种的鲎，前者的诊断推荐阈值为20ng/L，后者的诊断推荐阈值为60ng/L。
当发生IFI时，BG可以从真菌胞壁释放进入血液或其它体液当中，而浅表真菌感染（如口咽部念珠菌病等）或真菌定植时BG极少释放入血液中，因此血浆BG检测是筛选IFI的有用方法，具有临床诊断意义，在日本已广泛使用。G试验阳性提示可能为曲霉或念珠菌感染，但通常在临床症状和影像学出现变化数天后才表达阳性。临床有效的抗真菌治疗能降低血浆BG水平，连续检测有助于判断病情变化和治疗反应。临床研究表明，曲霉与念珠菌引起的IFI患者血浆BG水平高于诊断阈值，而细菌感染与真菌定植患者血浆BG水平与健康人相似，明显低于诊断阈值。采用Fungitec-G试剂盒时，国内BG检测诊断IFI的阈值可能以20ng/L较理想。
BG检测的敏感性和特异性各研究报道有较大差异，其临床应用价值还需要前瞻性、大样本的临床研究证实。Odabasi等采用Glucatell试剂盒测定了283例急性白血病或骨髓增生异常综合征患者不同时间点的血标本，以≥60pg/ml为诊断阈值时诊断IFI的敏感性为97%，特异性90%～96%，所有确诊或高度可疑的IFI患者在出现明显的临床症状之前，至少有一次血浆BG检测结果为阳性。
2.半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）抗原：GM是曲霉细胞壁上的一种多糖抗原，由核心和侧链两部分构成，核心为α-（1-2）（1-6）-糖苷键连接成的甘露聚糖，侧链主要由4-5个呋喃半乳糖组成。当曲霉在组织中侵袭、生长时可释放进入血循环。血清GM检测用来诊断曲霉感染始于1970年代，但因检测方法的敏感性太低而限制了其临床应用。1990年代初，建立了双夹心酶联免疫吸附（double-direct sandwich ELISA）方法检测GM抗原，可以检测到样本中0.5～1ng/ml的GM。商品化的检测试剂盒（Bio-Rad Platelia® Aspergillus）已于2003年5月获得美国FDA批准在临床使用，其诊断侵袭性曲霉病的敏感性为80.7%，特异性89.2%。
大鼠动物实验表明，血清GM检测能区分侵袭性肺曲霉感染与白念珠菌、毛霉、肺炎链球菌感染和烟曲霉口咽定植，以诊断阈值为1.5时，其诊断侵袭性肺曲霉感染的敏感性和特异性分别为79%和88%，且敏感性随感染时间的延长而提高。侵袭性曲霉病患者血清GM阳性表达可早于临床表现和影像学改变出现前数天，对高危患者连续动态监测（每周2次）具有早期诊断价值。Busca A等[9]前瞻性评价了GM检测与早期胸部CT检查对侵袭性肺曲霉病的诊断价值，共计74例血液系统恶性肿瘤接受同种干细胞移植的患者参与研究，以1.0为诊断阈值时，GM检测诊断侵袭性肺曲霉病的敏感性为100%、特异性93%。有4例发生侵袭性曲霉病的患者胸部CT异常表现滞后于GM阳性（中位时间5天），而另5例患者在GM检测出现阳性结果前（中位时间8天）即有胸部CT的改变。因此，联合进行GM检测与胸部CT检查更有助于早期诊断。初步研究发现，抗真菌治疗后血清GM升高者预后不良，提示连续的血清GM检测可能能够监测病情变化。
除了血清外，其它一些标本也可用于GM检测。Husain S等[10]前瞻性研究了肺移植患者支气管肺泡灌洗液中GM的检测，当诊断阈值为0.5时，诊断侵袭性肺曲霉病的敏感性和特异性分别为60%和95%，而阈值为1.0时，敏感性仍为60%，特异性增加至98%，但相关研究尚不多。
3.甘露聚糖（mannan）抗原：甘露聚糖是由甘露糖和少量蛋白质组成的一种糖蛋白，系酵母菌细胞壁的成分之一。酵母菌中导致侵袭性感染者主要为念珠菌属，少数为新生隐球菌，而隐球菌的厚荚膜使细胞壁上的甘露聚糖难以释放入血，不易测得，所以血浆中甘露聚糖抗原阳性与侵袭性念珠菌感染有高度相关性，可用于早期诊断侵袭性念珠菌感染。甘露聚糖分为α-甘露聚糖和β-甘露聚糖，目前已有分别检测这两种甘露聚糖的方法，前者的敏感性更高，两者联合检测诊断侵袭性念珠菌感染的敏感性可达90%，特异性为95%。最近开发的用于血清甘露聚糖检测的商业化试剂盒（Unimedi Candida monotest）操作简便、快捷，只需1小时出结果，而且费用较低廉，诊断念珠菌血症的敏感性和特异性分别为82%和96%[11]。
4.其他真菌抗原和真菌代谢产物检测：目前研究相对较多的真菌抗原还有烯醇化酶抗原、念珠菌热敏抗原和隐球菌荚膜多糖抗原、组织胞浆菌抗原等。烯醇化酶广泛存在于真菌细胞和其它生物体内，不同真菌所含烯醇化酶抗原有差异。48kD烯醇化酶为念珠菌属特异性抗原，对念珠菌有较高的属特异性。念珠菌热敏抗原是念珠菌细胞壁的成分之一，对热不稳定。48kD烯醇化酶和念珠菌热敏抗原检测可用于侵袭性念珠菌感染的诊断，并有可能作为监测病情变化的手段。隐球菌荚膜多糖抗原检测是目前诊断隐球菌感染的重要方法，检测方法有多克隆IgG抗体法和鼠单克隆IgM抗体法，或多克隆抗体和单克隆抗体联合检测，联合检测可降低假阳性。组织胞浆菌抗原在流行区的应用较多。
真菌感染过程中会产生代谢产物，D-阿拉伯糖醇是第一个用于诊断研究的真菌特异性代谢产物，除克柔和光滑念珠菌之外其他念珠菌均可产生。侵袭性念珠菌感染时，血浆D-阿拉伯糖醇浓度升高，而念珠菌定植者不升高。
二、抗原检测诊断时值得注意的问题
我国制定的真菌感染诊断标准与治疗原则中，均规定血液G试验GM检测需连续2次阳性才能作为微生物学诊断的依据，以保证结果的可靠性。同时因目前有不同的市售检测试剂盒，也没有给出每一种试验的具体判定数据，需要根据具体采用的试剂盒的标准进行判定。此外，对于其他体液，如脑脊液、胸腹水、支气管肺泡灌洗液、尿液等也可检测真菌抗原，但由于判定折点、敏感性和特异性等问题尚未解决，目前将其作为诊断依据尚未得到公认。
1．1,3-β-D-葡聚糖：肺曲霉球内的曲霉呈寄居状态而非侵袭性感染，接合菌和新生隐球菌细胞壁不含BG或含量极低，新生隐球菌又具有厚荚膜难以将BG释放入血，所以血浆中BG水平一般不升高，故BG检测不能用于接合菌、新生隐球菌感染和曲霉球的诊断。BG检测的局限性还在于没有种属特异性，不能区别曲霉与酵母菌感染。检测过程中须对所需器皿严格进行灭菌、去热源处理，操作中坚持无菌原则，因为取标本或操作过程中的污染是导致假阳性的主要原因，溶血、血液透析（纤维素膜）、静脉使用白蛋白或γ球蛋白，以及使用香菇菌多糖的患者也可出现假阳性结果。某些抗菌药物，如粘菌素E、厄他培南、头孢噻肟、头孢吡肟、氨苄西林－舒巴坦和磺胺类药物有可能导致BG检测呈假阳性，但还有待证实[7]。
2．半乳甘露聚糖：血清GM检测诊断侵袭性曲霉病的阈值仍存争议。应用同样的试剂和方法检测曲霉抗原，美国判定的阳性结果为 I＞0.5，而欧洲判定的阳性结果为 I＞1.0或1.5，国内尚缺少相关研究。因此，判定的折点尚不统一。近年来经过大量临床实践，欧美专家逐步认可将判定折点定为0.8或2次＞0.5，但仍需要更多的循证医学证据来证实其诊断的可靠性。对中性粒细胞缺乏宿主的侵袭性曲霉感染，GM检测的敏感性和特异性均较高，有重要辅助诊断价值，特别是 I＞1.0～1.5或随访呈现进行性升高者。但在其他类型曲霉感染（如慢性坏死性肺曲霉病、气道侵袭性曲霉感染等）GM试验诊断意义尚不明确，对非中性粒细胞缺乏患者的诊断价值尚有争议。
多种曲霉细胞壁上均存在GM，GM检测不能区分曲霉菌种。已知念珠菌的细胞壁中无GM，但在某些霉菌的细胞壁中存在类似GM的结构，如青霉属、红色毛癣菌、支孢霉属和地丝菌属等，可与曲霉GM发生交叉反应，导致假阳性结果，通常假阳性结果血清GM的检测值较低。一般认为，隐球菌感染者GM检测应为阴性，但Dalle F等报道了1例无曲霉病证据的隐球菌感染患者血清曲霉GM检测阳性，可能新生隐球菌荚膜中包含有能与曲霉GM起交叉反应的抗原表位。还有少数情况可以导致GM检测出现假阳性结果，如使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦、食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等。此外，标本或诊断试剂污染也可造成血清GM检测假阳性。释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除，这是造成假阴性的原因之一，多次复查可以提高检出率。
近来来，尽管在真菌菌体成分、真菌抗原以及真菌代谢产物检测诊断IFI方面开展了较多的研究，但不同的研究结果之间存在较大差异，尤其是哪些因素会影响检测结果或影响的程度有多大均尚需进一步探讨。因此，真菌抗原检测的临床应用价值仍有待于进一步的评价。
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施毅 南京军区南京总医院 |
